Методы введения рекомбинантных ДНК в клетки
Учебные материалы по биологии / Генная инженерия / Методы введения рекомбинантных ДНК в клетки
Страница 2

ДЭАЭ-декстрановый метод довольно прост и дает высоковоспроизводимые результаты. К недостаткам метода можно отнести то, что для некоторых культур клеток ДЭАЭ-декстран может быть токсичен при использовании его в высокой концентрации. Кроме того, эффективность трансфекции может существенно зависеть от качества препарата ДЭАЭ-декстрана.

Кальций-фосфатный метод. Является модификацией ДЭАЭ-декстранового метода. На монослой клеток КВ, предварительно обработанных ДЭАЭ-декстраном, наносят ДНК аденовируса Аd5 в растворе СаCl2. При этом эффективность трансфекции повышается в 10-100 раз. Аналогичные результаты получаются, когда клетки не обрабатывают ДЭАЭ-декстраном. Поскольку в питательной среде присутствуют фосфаты, при добавлении раствора хлорида кальция образуется осадок фосфата кальция. Удаление этого осадка из среды приводит к потере инфекционности ДНК. Таким образом, трансфекция происходит в результате соосаждения вирусной ДНК и образующихся микрокристаллов фосфата кальция на клеточный монослой.

На примере ДНК вируса простого герпеса показано, что сразу после соосаждения с фосфатом кальция вирусная ДНК становится устойчивой к разрушению ультразвуком, но комплекс фосфат кальция - ДНК остается чувствительным к ДНКазе в течение 4 ч. При взаимодействии этого комплекса с культурой клеток животных ДНК становится устойчивой к ДНКазе уже в течение первого часа. ДНК образует с фосфатом кальция прочный комплекс, который при оптимальных условиях поглощают практически все реципиентные клетки. Эффективность поглощения клетками комплекса фосфат кальция - ДНК в значительной степени зависит от рН, при котором формировался этот комплекс, и концентрации ДНК. Важно, чтобы осадок фосфата кальция получился мелкодисперсным. Но даже в оптимальных условиях проведения трансфекции данным методом лишь в 1-5 % клеток комплекс достигает ядра. По-видимому, проникновение ДНК из цитоплазмы в ядро является критическим этапом, наиболее сильно влияющим на эффективность трансфекции клеток вирусной ДНК.

Кальций-фосфатный метод обычно более эффективен, чем ДЭАЭ-декстрановый, при трансфекции линейными вирусными ДНК и заметно уступает последнему при использовании кольцевых молекул ДНК. Вероятно, образование микрокристаллов фосфата кальция и соосаждение с ними молекул ДНК сопровождается нарушением структуры части этих макромолекул. Особенно данный эффект сказывается на лабильных кольцевых молекулах ДНК, которые после разрыва цепей и перехода в линейную форму уже не инфекционны. ДЭАЭ-декстрановый метод, как более мягкий, обеспечивает значительно большую эффективность проникновения кольцевых молекул ДНК в клетки животных в неповрежденном виде, хотя в целом доля клеток, поглотивших ДНК при обработке ДЭАЭ-декстраном, существенно меньше, чем при трансфекции кальций-фосфатным методом.

Метод инфекции. Под инфекцией в данном случае подразумевается введение в клетку рекомбинантных ДНК, упакованных в вирусные частицы (рекомбинанты, сконструированные с использованием λ-векторов или космид).

Для упаковки используют рекомбинантные молекулы, вектором в которых выступает ДНК фагов, утративших в результате мутации способность инициировать синтез белков-капсомеров. При помещении ДНК таких фагов в концентрированный экстракт лизогенных по данному вирусу клеток (в них содержаться все необходимые белки), происходит сборка in vitro вирусных частиц. Сформированными таким способом частицами можно заражать бактериальные клетки и получить фаговое потомство.

В капсид упаковываются молекулы ДНК, близкие по размеру фаговому геному, поэтому в бактериальные клетки попадает лишь ДНК заданного размера. Кроме того, в капсиды не упаковываются многочисленные побочные продукты лигазной реакции.

Метод позволяет эффективно клонировать чужеродную генетическую информацию в клетках бактерий.

Микроинъекция вирусных молекул ДНК. Метод впервые воспроизведен А. Грессманом в 1970 г. при введения молекул ДНК в культивируемые клетки млекопитающих. Процедура заключается во введении в клетку (цитоплазму или ядро) малых объемов жидкости (около 10-8 мкл) с помощью стеклянного микрокапилляра. Эксперимент проводится на предметном столике микроскопа с применением микроманипуляторов и микрошприцев. Используя эту методику, удалось изучить биологическую активность молекул ДНК разных вирусов. К достоинствам метода относится то, что определенное количество препарата ДНК можно ввести в выбранную область клетки, в частности в ядро. Недостатком метода является его сложность и невысокая производительность. Кроме того, по-видимому, он применим лишь к небольшим молекулам ДНК, так как при продавливании через микрокапилляр целостность больших молекул ДНК будет нарушаться вследствие гидродинамического сдвига. В силу отмеченных недостатков метод микроинъекции ДНК используется крайне редко.

Страницы: 1 2 3

Смотрите также

Биогеохимия: история и современность
Введение Биогеохимия - наука, изучающая жизнедеятельность организмов в качестве ведущего фактора миграции и распределения масс химических элементов на Земле. Предметом изучения биогео ...

Степной сурок Удмуртской Республики
ВВЕДЕНИЕ Байбак, или степной сурок (Marmota bobak Mull.) является типичным обитателем степей Евразии, где играет важную биоценотическую роль. Это охотничий зверь, и многие годы на всей ...

Взаимосвязь обменов в организме. Патохимия сахарного диабета
...

 
 




Copyright © 2013 - Все права защищены - www.biotheory.ru