Свойство и структура ПГА - синтазы, выделенной из R.eutropha
Страница 1

В настоящее время выделено и охарактеризовано более 50 структурных генов синтаз из разных микроорганизмов. ПГА - синтаза из R.eutropha состоит из одного типа субъедениц с молекулярной массой около 64 кДа и кодируется геном phbC. В клетке ПГА - синтаза находится в двух формах: растворимой и связанной с гранулами полимера. Обе формы наиболее активно используются для построения полимерных молекул короткоцепочечных (от 3 до 5 атомов углерода) 3-гидроксиацил-КоА и это свидетельствует о строгой специфичности фермента к короткоцепочечным производным. Эти данные были подтверждены в системе синтеза полимера in vitro. ПГА - синтаза, выделенная из рекомбинантного штамма Е. coli, с трансформированным ПГА - синтазным геном из R.eutropha, высокоактивна с 3-ОН-С4-КоА и 3-ОН-С5-КоА субстратами. С 3-ОН-С6-КоА активность фермента резко снижается и составляет всего 0.94% от таковой с гидроксибутират-КоА. Наибольшее сродство фермент имеет по отношению к кислотам с ОН-группой в β-положении. Перемещение ОН-группы к метильному концу снижает способность субстрата связываться с ферментом, однако не влияет на скорость синтеза полимера. Также доказано, что локализация гидроксила у карбоксильного конца полностью дезактивирует фермент. К настоящему моменту показано, что субстратная специфичность ПГА - синтазы in vivo может существенно отличаться от ее характеристик in vitro. ПГА - синтаза in vivo может включать в полимер в небольших количествах и более длинные гидроксикислоты - С6, С8 и С10. Это свидетельствует о более широком спектре субстратов, используемых синтазой для построения полимеров. Разница в субстратной специфичности фермента in vivo и in vitro может быть связана со сроками наблюдения за включением субстратов в ПГА, или разницей в специфической среде окружения фермента. Полученные данные свидетельствуют о конститутивном синтезе ПГА-синтазы. Например, в условиях лимита по углероду R.eutropha синтезирует преимущественно растворимую форму фермента, а при переносе культуры в условия дефицита азота, активность растворимой ПГА-синтазы резко падает, и в клетках в основном определяют гранулозависимую форму фермента. При этом суммарная активность фермента остается на одном и том же уровне (0.05 u/mg protein). Растворимую форму ПГА-синтазы в достаточном количестве выделили из рекомбинантного штамма Е. coli, который содержал ПГА - синтазный ген. Рекомбинант оказался способным синтезировать фермент с высоким выходом, но так как в среде отсутствовали субстраты, в клетках накапливалась только растворимая форма фермента. Молекулярный вес растворимой синтазы составляет 64 кДа. Кинетический анализ показал, что реакция полимеризации 3-ОН-С4-КоА с этим ферментом начинается после достаточно продолжительной лаг фазы, которая увеличивалась при снижении концентрации фермента в реакционной смеси. Эти наблюдения позволили предположить, что для сокращения длительности лаг фазы необходим праймер, который позволил бы переводить фермент из мономерного в димерное состояние. И, действительно, использование в реакции полимеризации олигомера 3-ОН-С4 исключило лаг фазу, а в реакционной смеси при этом обнаружили мономерные и димерные формы фермента. К настоящему времени доказано, что только димерная форма фермента обладает каталитической активностью. Это хорошо согласуется с механизмом реакции полимеризации, согласно которому в реакцию полимеризации должны включаться две тиольные группы. Однако у ПГА - синтазы обнаружен только один цистеин в положении 319, отвечающий за образование полимерных цепей. Достаточно много было выдвинуто предположений о посттрансляционных модификациях фермента пантотеновой кислотой, которая могла бы ввести вторую тиольную группу для успешной работы фермента. Однако наиболее доказательной оказалась модель образования активного фермента в виде димера, у которого две тиольные группы расположены в Cys319, локализующие в консервативном участке субъединиц. На основании этих данных была предложена модель - механизм полимеризации мономеров, аналогичный синтезу ацильных цепей жирных кислот, согласно которой димеризация ПГА - синтазы необходима для формирования активного центра с двумя идентичными тиольными группами. Последние образуют сайты связывания с субстратом и растущей полимерной цепью, при этом растущая цепь переходит с одной тиольной группы на другую. Растущая цепь полимера стабилизирует димерную структуру фермента; последний находится в клетке в гранулосвязанной форме и локализуется на поверхности полимерных гранул.

Страницы: 1 2

Смотрите также

Производство гипотез в естествознании. Наука эпохи Возрождения. Гипотезы происхождения человека
...

Этапы онтогенеза высших растений
Введение Онтогенезом называют индивидуальное развитие организма от зиготы (или вегетативного зачатка) до естественной смерти. В ходе онтогенеза реализуется наследственная информация ...

Медоносные растения окрестностей селения Миглакаси Сергокалинского района
Введение Растительный мир селении Миглакаси очень разнообразен. При изучении растительного покрова сел. Миглакаси раскрываются черты его замечательного богатства и своеобразия. Именн ...

 
 




Copyright © 2013 - Все права защищены - www.biotheory.ru