Методы конструирования рекомбинантных ДНК in vitro

Учебные материалы по биологии / Генная инженерия / Методы конструирования рекомбинантных ДНК in vitro

Страница 1

Конструирование рекомбинантных молекул ДНК, независимо от выбранного метода, сводится к следующим задачам:

) Получение целевого фрагмента (или смеси фрагментов) ДНК путем разрезания с помощью рестриктаз молекулы ДНК, выделенной из конкретного организма.

2) Разрезание векторной молекулы с помощью рестриктазы в определенном участке (сайте рестрикции).

) Вставка и последующее вшивание целевого фрагмента ДНК в вектор в месте разреза.

Впервые подобная операция была произведена в 1972 г. группой американских генетиков из Стенфордского университета под руководством Пола Берга. Ими была получена in vitro гибридная молекула, состоящей из ДНК вируса SV40 и ДНК фага λdvgal. Использованный при этом алгоритм действий получил название коннекторного метода. В 1980 г. за свое открытие Пол Берг был удостоен Нобелевской премии в области химии.

Принцип коннекторного метода (см. рис. 1). К 3'-концам одного из рекомбинируемых in vitro фрагментов ДНК с помощью фермента терминальная трансфераза достраивают одноцепочечные сегменты определенной длины, состоящие из адениновых нуклеотидов (олиго(dA)-сегменты), а к концам другого фрагмента - комплементарные им олиго(dT)-сегменты (состоящие из тиминовых оснований) примерно такой же длины. При смешении полученных таким образом фрагментов формируются кольцевые структуры за счет водородных связей между олиго(dA)- и олиго(dT)-последовательностями. Одноцепочечные бреши гибридных молекул ДНК застраивают с помощью ДНК-полимеразы и цепи ковалентно сшивают в лигазной реакции.

Рис. 1. Схема коннекторного метода создания рекомбинантных ДНК

На следующий год после экспериментов П. Берга, другой американский биохимик С. Коэн с сотрудниками предложил более простой метод конструирования гибридных молекул ДНК, основанный на применении двух ферментов: рестриктазы и ДНК-лигазы. Рестриктазно-лигазный метод быстро завоевал популярность и используется до сих пор как наиболее простой и надежный.

Принцип рестриктазно-лигазного метода. Данный метод состоит из трех этапов (см. рис. 2):

1) рестриктазой класса II специфически разрезают молекулы ДНК на фрагменты, имеющие идентичные взаимокомплементарные липкие концы;

) препараты различных молекул ДНК, гидролизованных одной и той же рестриктазой, смешивают, и при определенных условиях липкие концы разных фрагментов ДНК реассоциируют за счет комплементарного взаимодействия;

) с помощью ДНК-лигазы происходит ковалентное связывание ассоциированных фрагментов ДНК.

Рис. 2. Схема рестриктазно-лигазного метода создания рекомбинантных ДНК

Рестриктазно-лигазный метод, по сравнению с коннекторным методом, находит более широкое применение в генно-инженерных манипуляциях, поскольку он более прост биохимически и, кроме того, дает возможность легко выщепить встроенный фрагмент из гибридной молекулы ДНК, что часто бывает важно при переносе фрагмента в другое генетическое окружение.

Данный метод позволяет использовать в каждом конкретном эксперименте одновременно две рестриктазы. Комбинируемые молекулы ДНК при этом могут иметь разные липкие концы. В этом случае фрагменты объединяются в строго определенной ориентации относительно друг друга. При смешении же фрагментов, полученных после гидролиза одной рестриктазой, возможны различные их ориентации в формирующихся гибридных молекулах ДНК. Более того, в процессе лигазной реакции может происходить ковалентное объединение не только двух, но и трех, а также большего числа фрагментов.