Методы конструирования рекомбинантных ДНК in vitro

Учебные материалы по биологии / Генная инженерия / Методы конструирования рекомбинантных ДНК in vitro

Страница 2

По такой схеме могут быть ковалентно соединены in vitro два и более любых фрагмента, полученных при гидролизе молекул ДНК одной и той же рестриктазой. Однако в первоначальном виде метод имеет существенное ограничение, связанное с тем, что с помощью рестриктаз (особенно одного фермента) в каждом конкретном случае можно получить лишь специфический, строго определенный набор фрагментов изучаемой ДНК. Для преодоления этого недостатка была разработана модификация, основанная на использовании линкерных молекул (линкеров) - синтетических сегментов ДНК, содержащих в своем составе последовательности, узнаваемые рестриктазами. Метод предложили Р. Шеллер с сотрудниками в 1977 г. Он позволяет достаточно просто рекомбинировать in vitro практически любые фрагменты ДНК.

Модификация рестриктазно-лигазного метода с использованием линкеров. Разработанный подход включает следущие операции (рис. 3):

1) по тупым или липким концам фрагмента ДНК, который предполагается рекомбинировать, с помощью лигазы фага Т4 пришивают короткие синтетические двухцепочечные сегменты, имеющие участки узнавания определенной рестриктазы;

2) полученный фрагмент обрабатывают выбранной рестриктазой, в результате чего образуются липкие концы;

) полученный фрагмент рекомбинируют in vitro с другими молекулами ДНК по обычной схеме рестриктазно-лигазного метода.

Рис. 3. Схема создания рекомбинантных ДНК с использованием линкерных молекул

Использование линкерных молекул делает рестриктазно-лигазный метод рекомбинации фрагментов ДНК in vitro универсальным, поскольку исходные фрагменты можно получать самыми различными способами.

Практическое занятие №2