Выделение тотальной ДНК

Учебные материалы по биологии / Использование микросателлитного анализа ДНК для изучения популяций кумжи (Salmo Trutta L.) в реках Абхазии / Выделение тотальной ДНК

Чтобы проводить молекулярный анализ нуклеиновых кислот, нужно получить их в относительно чистом виде. Перед выделением ДНК образец ткани (часть хвостового плавника рыбы) извлекали из коллекционной пробирки и ножницами отделяли фрагменты необходимого размера. Мелкие фрагменты исследуемой ткани затем переносили в отдельную чистую пробирку.

Для экстракции ДНК применяли солевой метод (модифицированный) (Приложение 5). Для выделения ДНК этим методом необходимы следующие компоненты:

. лизирующий буфер.

. раствор протеиназы К (20 мг/мл)

. раствор 6М NaCl

. изопропанол

. 70% этанол

. бидистилят

Состав лизирующего буфера следующий: 0,4М NaCl; .01M TrisHCl (pH8.0); 2 mM EDTA (pH 8.0); 2% SDS.

На 100 мл лизирующего буфера приходятся следующие компоненты:

мкл 4М-ого NaCl

мкл 1М-ого TrisHCl (pH 8.0)

мкл 0,5М-ого EDTA (pH 8.0)

мкл 20%-ого SDS

,6 мл воды

SDS (додецилсульфат) ─ поверхностно-активное вещество, создающее на белках сильный отрицательный заряд, вследствие чего происходит их денатурация и отделение от нуклеиновых кислот. Вызывает разрушение структуры мембран, вследствие разрушения её белковых составляющих.

EDTA (этилендиаминтетраацетат) ─ хелатирующий агент, связывающий ионы металлов переменной валентности; используется для устранения ингибирования катализируемых ферментами реакций следовыми количествами тяжёлых металлов.

Для выделения ДНК данным методом необходимо осуществить следующие процедуры:

. навеску ткани поместить в 1,5мл-ую пробирку с 400 мкл лизирующего буфера и 2 мкл раствора протеиназы К. Оставить для лизиса на ночь или 2-3 часа при температуре +580С и периодическом перемешивании.

. к лизату добавить 300 мкл 6М NaCl, перемещать 30с на вортексе и осадить центрифугированием при 10тыс./мин. в течение 30мин.

. отобрать в чистые пробирки верхнюю фазу (около 600мкл), стараясь не трогать возможную липидную пленку сверху.

. к верхней фазе прилить 600 мкл изопрапанола для осаждения ДНК. Смешать. Оставить при минус 200С на 20 минут.

. отцентрифугировать при 10тыс./мин. в течение 20мин.

. отобрать изопрапаноловый спирт, промыть осадок 70%-ым этанолом, добавляя 500 мкл этанола и центрифугирования при 12тыс./мин. в течение 12мин.

Осадок ДНК должен быть белым или бесцветным, поэтому цветной осадок 70%-ым этанолом можно промыть неоднократно.

. спирт слить, подсушить осадок в течение 5-10 минут при 370С.

. растворить осадок в бидистиляте в течение 10 минут при 500С.