Методы идентификации клонов, содержащих рекомбинантные ДНКУчебные материалы по биологии / Генная инженерия / Методы идентификации клонов, содержащих рекомбинантные ДНКСтраница 2
Обычно размер зонда варьирует от 100 до 1000 п. н., хотя можно использовать как более крупные зонды, так и зонды меньшего размера. Для гибридизации, т. е. для образования стабильного комплекса, необходимо, чтобы на участке длиной 50 нуклеотидов совпадало более 80% из них, но это зависит от условий реакции.
Радиоиммунологический скрининг. Данный метод применяется в случае, если клонируемый ген активно экспрессируется в клетке-хозяине. Продукцию экспрессии гена - белок или его часть, можно обнаружить иммунологическими методами.
В основу метода положена способность молекул иммуноглобулинов связываться с полистиролом или поливинилом. Необходимым условием является наличие у исследуемого белка не менее двух антигенных детерминант, что дает ему возможность связывать по крайней мере две разные молекулы иммуноглобулинов.
Принцип метода. Колонии трансформантов перепечатывают идентичным образом на две чашки с агаризованной питательной средой и чашки инкубируют до получения колоний необходимого размера. Затем на одной из чашек лизируют бактериальные клетки и прижимают к поверхности среды поливиниловый диск с адсорбированными на нем специфическими антителами. При этом на диске происходит иммуносорбция антигена. После промывания диска на него наносят 125I-меченные антитела (препарат поликлональных иммуноглобулинов) к белку искомого гена. Таким образом, при наличии в чашке специфического белка (антигена), на фильтре образуется комплекс «антитело 1-антиген-антитело 2». Первое антитело служит для прикрепления комплекса к фильтру, второе является маркером, позволяющим выявить колонии, в которых образовался комплекс, методом радиоавтографии.
Из соответствующих колоний с матричных чашек бактерии пересевают на питательные среды и проводят анализ содержащихся в них гибридных плазмид.
Практическое занятие №4
Смотрите также
Синтетическая теория эволюции: проблемы и перспективы развития
...
Теория "естественного отбора" Ч. Дарвина
Введение
В 2001 году исполнилось 142 года со дня выхода в свет
“Происхождения видов” и торжества теории эволюции. Просвещенная общественность
настолько сжилась с представлениями Дарви ...
Строение и повадки пауков
ПАУКИ
(Aranei),
отряд класса паукообразных, включающего также клещей, скорпионов, сенокосцев и
т.п. Пауки по ряду признаков близки к насекомым, но четко от них отличаются, и
связаны эти гр ...